علم الأحياء / PCR
حاسبة Tm للبادئ (درجة الانصهار)
احسب درجة انصهار بادئ PCR بطريقة الجار الأقرب مع تصحيح الملح، وقاعدة Wallace، وصيغة GC، مع نسبة GC وتحذير من مقاطع متتامّة ذاتيًا قد تكوّن دبابيس شعرية أو ثنائيات.
حاسبة Tm للبادئ (درجة الانصهار): تضيف قيمة Tm بطريقة الجار الأقرب الإنثالبي والإنتروبي لكل زوج قواعد متداخل من جدول SantaLucia الموحد لعام 1998، مع تصحيحات النهايات والملح، وتحل المعادلة Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15. عند استخدام C/4 بوصفه تركيز السلسلة، كما يفعل Primer3، تتوافق النتيجة مع Tm_NN في Biopython ضمن 0.01 °C: إذ تبلغ قيمة البادئ العكسي M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA عند 250 nM و50 mM من Na⁺ مقدار 56.7 °C. وتعطي قاعدة Wallace، بمقدار 2 °C لكل A أو T و4 °C لكل G أو C، قيمة 68 °C له، ولا تناسب إلا قليل النيوكليوتيدات القصيرة. يعمل 100% محليًا في المتصفح، من دون رفع أي ملفات إلى الخادم.
- مرات التشغيل
- في المتصفح
- التكلفة
- مجاني · بلا تسجيل
- التوفر
- جاهز للاستخدام
تعمل بالكامل في المتصفح
يجمع أسلوب الجار الأقرب استقرار كل زوج متداخل من القواعد، باستخدام القيم الموحدة لعام 1998 من SantaLucia مع تصحيح الملح الخاص به، ويعطي درجة الحرارة التي ترتبط عندها نصف البادئة؛ ومع استخدام C/4 لتركيز السلسلة، كما يفعل Primer3، تتطابق النتيجة مع Tm_NN في Biopython حتى 0.01 °C. تُعد قاعدة Wallace وصيغة GC تقريبات أسرع. تتكون بادئات PCR الجيدة عادةً من 18–25 قاعدة، مع 40–60% GC، وينبغي ألا يتجاوز الفرق بين زوج البادئات نحو 5 °C؛ وتكون درجة حرارة التلدين المعتادة أقل من Tm الأدنى بمقدار 3–5 °C. كما يرفع Mg²⁺ وdNTPs، اللذان لا يحاكيهما هذا الحساب، قيمة Tm.
إرشادات تصميم البوادئ
استهدف 18–25 قاعدة، ونسبة GC تبلغ 40–60%، ووجود G أو C عند الطرف 3′، ومن دون تتابعات من أربع قواعد أو أكثر من النوع نفسه، على أن تكون قيم Tm للزوج ضمن 5 °C من بعضها.
للتحقق من تسلسل القالب وتسلسل البادئ العكسي، استخدم أدوات تسلسل DNA.
التركيزات
تؤدي زيادة تركيز البادئ أو الملح إلى رفع Tm: إذ تزداد Tm للبادئ نفسه بنحو 1–2 °C عند الانتقال من 50 إلى 100 mM من Na⁺. كما يعمل Mg²⁺، الذي تحتوي عليه محاليل PCR المنظمة بتركيز 1.5–2.5 mM، على زيادة استقرار الثنائيات، لكن هذا العامل غير ممثل في النموذج هنا.
لتحضير محاليل البوادئ المركزة والتخفيفات العاملة، استخدم حاسبة التخفيف.
طريقة الاستخدام
- ألصق البادئ، مكتوبًا من 5′ إلى 3′.
- اضبط تركيزَي البادئ والصوديوم إذا كان المحلول المنظم مختلفًا.
- اقرأ قيمة Tm بكل طريقة، ونسبة GC، وأي مقطع متتامٍ ذاتيًا.
الخصوصية والقيود
تُجرى جميع الحسابات في المتصفح.
أدوات ذات صلة
الأسئلة الشائعة
أي قيمة Tm ينبغي استخدامُها؟
استخدم قيمة الجار الأقرب، فهي تراعي ترتيب التسلسل والمحلول المنظم. تضيف حاسبات كثير من مورّدي البوليميراز تصحيحاتها الخاصة للمحلول المنظم، لذلك توقّع فروقًا تبلغ بضع درجات.
ما درجة حرارة التلدين التي ينبغي ضبطها؟
تكون عادةً أقل بـ 3–5 °C من قيمة Tm الأقل للزوج، ثم حسّنها باستخدام PCR بتدرج حراري.
لماذا يهم تحذير التتام الذاتي؟
يمكن لبادئ يقترن بنفسه أو بالبادئ المقابل أن يكوّن ثنائيات أو دبابيس شعرية تنافس الهدف وتنتج حزمًا إضافية.
أداة مجانية · عدد مرات الاستخدام في المتصفح · لا يتطلب حسابًا