Biologie / PCR
Primer-Tm-Rechner (Schmelztemperatur)
Ermittle die Schmelztemperatur eines PCR-Primers mit der Nearest-Neighbour-Methode und Salzkorrektur, der Wallace-Regel und der GC-Formel sowie seinen GC-Gehalt und mögliche selbstkomplementäre Abschnitte, die Haarnadeln oder Dimere bilden können.
Primer-Tm-Rechner (Schmelztemperatur): Die Tm nach der Nearest-Neighbour-Methode addiert die Enthalpie und Entropie jedes überlappenden Basenpaars aus SantaLucias vereinheitlichter Tabelle von 1998, einschließlich Korrekturen für Enden und Salz, und löst Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273,15. Bei C/4 als Strangkonzentration, wie bei Primer3, stimmt das Ergebnis bis auf 0,01 °C mit Biopythons Tm_NN überein: Der M13-Reverse-Primer AGCGGATAACAATTTCACACAGGA bei 250 nM und 50 mM Na⁺ ergibt 56,7 °C. Die Wallace-Regel mit 2 °C pro A oder T und 4 °C pro G oder C ergibt dafür 68 °C und eignet sich nur für kurze Oligos. Läuft zu 100% lokal in deinem Browser, ohne Datei-Uploads zum Server.
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Die Nächste-Nachbarn-Methode addiert die Stabilität jedes überlappenden Basenpaars anhand der vereinheitlichten Werte von SantaLucia aus dem Jahr 1998 einschließlich seiner Salzkorrektur und gibt die Temperatur an, bei der die Hälfte des Primers gebunden ist. Mit C/4 als Strangkonzentration, wie bei Primer3, stimmt sie bis auf 0.01 °C mit Biopythons Tm_NN überein. Die Wallace-Regel und die GC-Formel sind schnellere Näherungen. Gute PCR-Primer haben normalerweise 18–25 Basen und 40–60 % GC; ein Primerpaar sollte höchstens etwa 5 °C auseinanderliegen. Eine typische Annealing-Temperatur liegt 3–5 °C unter dem niedrigeren Tm. Mg²⁺ und dNTPs, die hier nicht modelliert werden, erhöhen Tm ebenfalls.
Richtlinien für das Primerdesign
Strebe 18–25 Basen, 40–60 % GC, ein G oder C am 3′-Ende, keine Abfolgen aus vier oder mehr gleichen Basen und für das Primerpaar Tm-Werte an, die höchstens 5 °C auseinanderliegen.
Um die Sequenz der Vorlage und des umgekehrten Primers zu prüfen, nutze die DNA-Sequenztools.
Konzentrationen
Eine höhere Primer- oder Salzkonzentration erhöht die Tm: Derselbe Primer gewinnt bei einer Erhöhung von 50 auf 100 mM Na⁺ ungefähr 1–2 °C. Mg²⁺, das in PCR-Puffern in einer Konzentration von 1,5–2,5 mM enthalten ist, stabilisiert Duplexe zusätzlich, wird hier jedoch nicht modelliert.
Um Primer-Stammlösungen und Arbeitsverdünnungen herzustellen, nutze den Verdünnungsrechner.
So benutzt du es
- Füge den Primer in der Richtung 5′ bis 3′ ein.
- Passe die Primer- und Natriumkonzentration an, wenn dein Puffer abweicht.
- Lies die Tm nach jeder Methode, den GC-Gehalt und mögliche selbstkomplementäre Abschnitte ab.
Datenschutz & Einschränkungen
Alles wird in deinem Browser berechnet.
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Häufige Fragen
Welche Tm sollte ich verwenden?
Den Wert nach der Nearest-Neighbour-Methode: Er berücksichtigt die Reihenfolge der Sequenz und den Puffer. Die Rechner vieler Polymerasehersteller berücksichtigen eigene Pufferkorrekturen, daher sind Abweichungen von einigen Grad zu erwarten.
Welche Annealing-Temperatur sollte ich einstellen?
Normalerweise 3–5 °C unter der niedrigeren Tm des Primerpaars; optimiere sie anschließend mit einer Gradient-PCR.
Warum ist der Hinweis auf Selbstkomplementarität wichtig?
Ein Primer, der mit sich selbst oder seinem Partner paart, kann Dimere oder Haarnadeln bilden. Diese konkurrieren mit dem Ziel und können zusätzliche Banden erzeugen.
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