生物学 / PCR
引物Tm计算器（熔解温度）
使用带盐校正的最近邻法、Wallace规则和GC公式计算PCR引物的熔解温度，同时显示其GC含量，并警告可能形成发卡结构或二聚体的自互补序列。
引物Tm计算器（熔解温度）: 最近邻Tm会根据SantaLucia的1998年统一表，累加每个重叠碱基对的焓和熵，并进行末端和盐校正，然后求解Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15。以C/4作为链浓度（与Primer3的做法一致）时，结果与Biopython的Tm_NN相差不超过0.01 °C：M13反向引物AGCGGATAACAATTTCACACAGGA在250 nM和50 mM Na⁺条件下的结果为56.7 °C。Wallace规则按每个A或T计2 °C、每个G或C计4 °C，计算该引物得到68 °C，仅适用于较短的寡核苷酸。 完全在浏览器中本地运行，文件不会上传到服务器。
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最近邻方法使用SantaLucia 1998年的统一数值及其盐校正，将每一对重叠碱基的稳定性相加，并给出一半引物结合时的温度；按照Primer3的做法，以C/4作为链浓度时，其结果与Biopython的Tm_NN相差不超过0.01 °C。Wallace规则和GC公式是更快的近似方法。优质PCR引物通常含有18–25个碱基，GC含量为40–60%；一对引物的Tm相差应在约5 °C以内；典型的退火温度比较低的Tm低3–5 °C。此工具未建模的Mg²⁺和dNTP也会升高Tm。
引物设计指南
建议长度为18–25个碱基，GC含量为40–60%，3′端为G或C，不要连续出现四个或更多相同碱基，并确保一对引物的Tm值相差不超过5 °C。
如需检查模板和反向引物的序列，请使用DNA序列工具。
浓度
提高引物浓度或盐浓度会提高Tm：同一条引物的Na⁺浓度从50提高到100 mM时，Tm大约升高1–2 °C。PCR缓冲液中含有1.5–2.5 mM的Mg²⁺，它会进一步稳定双链，但本工具未对其进行建模。
如需配制引物储备液和工作稀释液，请使用稀释计算器。
使用方法
- 粘贴按5′到3′方向书写的引物。
- 如果缓冲液不同，请调整引物浓度和钠离子浓度。
- 查看各方法计算出的Tm、GC含量，以及任何自互补序列。
隐私与限制
所有计算都在您的浏览器中完成，数据不会上传。
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常见问题
我应该使用哪个Tm？
使用最近邻法的结果：它会考虑序列顺序和缓冲液。许多聚合酶供应商的计算器还会加入自定义的缓冲液校正，因此结果相差几度是正常的。
应将退火温度设置为多少？
通常设置为引物对中较低Tm以下3–5 °C，然后通过梯度PCR进行优化。
为什么自互补警告很重要？
能与自身或配对引物结合的引物可能形成二聚体或发卡结构，与目标序列竞争并产生额外条带。
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