Biyoloji / PCR
Primer Tm Hesaplayıcı (Erime Sıcaklığı)
Bir PCR primerinin erime sıcaklığını tuz düzeltmeli en yakın komşu yöntemi, Wallace kuralı ve GC formülüyle hesaplayın; GC içeriğini ve saç tokası veya dimer oluşturabilecek öz-tamamlayıcı dizilerle ilgili uyarıyı görün.
Primer Tm Hesaplayıcı (Erime Sıcaklığı): En yakın komşu Tm hesaplaması, SantaLucia'nın 1998 birleşik tablosundaki örtüşen her baz çiftinin entalpi ve entropisini; uç ve tuz düzeltmeleriyle birlikte toplar ve Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273,15 formülünü çözer. Primer3'ün kullandığı iplikçik derişimi C/4 olarak alındığında, Biopython'un Tm_NN değeriyle 0,01 °C içinde uyumludur: 250 nM ve 50 mM Na⁺ koşullarındaki M13'ün ters primeri AGCGGATAACAATTTCACACAGGA için sonuç 56,7 °C'dir. A veya T başına 2 °C, G veya C başına 4 °C veren Wallace kuralı, bu primer için 68 °C sonucunu verir ve yalnızca kısa oligonükleotitler için uygundur. Sunucuya hiçbir dosya yüklenmeden tarayıcınızda %100 yerel olarak çalışır.
- Kategori
- Okul ve çalışma araçları
- Çalıştırma sayısı
- Tarayıcınızda
- Maliyet
- Ücretsiz · kayıt gerekmez
- Kullanılabilirlik
- Kullanıma hazır
Tamamen tarayıcınızda çalışır
En yakın komşu yöntemi, SantaLucia'nın 1998 tarihli birleştirilmiş değerlerini ve tuz düzeltmesini kullanarak örtüşen her baz çiftinin kararlılığını toplar ve primerin yarısının bağlandığı sıcaklığı verir; Primer3'ün kullandığı iplik konsantrasyonu için C/4 kullanıldığında Biopython'un Tm_NN değeriyle 0,01 °C farkla uyuşur. Wallace kuralı ve GC formülü daha hızlı yaklaşıklamalardır. İyi PCR primerleri genellikle 40–60% GC içeren 18–25 bazdan oluşur ve bir primer çifti birbirinden yaklaşık 5 °C içinde olmalıdır; tipik bağlanma sıcaklığı, düşük Tm değerinin 3–5 °C altındadır. Bu araçta modellenmeyen Mg²⁺ ve dNTP'ler de Tm'yi artırır.
Primer tasarım yönergeleri
18–25 baz uzunluğunu, %40–60 GC oranını ve 3′ ucunda bir G veya C bulunmasını hedefleyin; aynı bazdan art arda dört veya daha fazla bulunmamalı ve çiftteki Tm değerleri birbirinden 5 °C'den fazla farklı olmamalıdır.
Şablonu ve ters primerin dizisini kontrol etmek için DNA dizisi araçlarını kullanın.
Konsantrasyonlar
Primer konsantrasyonunu veya tuz konsantrasyonunu artırmak Tm'yi yükseltir: aynı primer, 50'den 100 mM Na⁺'a geçildiğinde yaklaşık 1–2 °C kazanır. PCR tamponlarının 1,5–2,5 mM içerdiği Mg²⁺, çift sarmalları daha da kararlı hâle getirir; ancak burada modellenmez.
Primer stokları ve çalışma seyreltmeleri hazırlamak için seyreltme hesaplayıcısını kullanın.
Nasıl kullanılır?
- 5′ → 3′ yönünde yazılmış primeri yapıştırın.
- Tamponunuz farklıysa primer ve sodyum derişimlerini ayarlayın.
- Her yönteme göre Tm değerini, GC içeriğini ve varsa öz-tamamlayıcı dizi bölümünü okuyun.
Gizlilik ve sınırlamalar
Her şey tarayıcıda hesaplanır.
İlgili araçlar
Sık sorulan sorular
Hangi Tm değerini kullanmalıyım?
En yakın komşu değerini kullanın; bu değer dizi sırasını ve tamponu dikkate alır. Birçok polimeraz tedarikçisinin hesaplayıcısı kendi tampon düzeltmelerini ekler; bu nedenle birkaç derecelik farklar bekleyin.
Hangi eşleşme sıcaklığını ayarlamalıyım?
Genellikle primer çiftindeki düşük Tm değerinin 3–5 °C altında bir sıcaklık seçin, ardından gradyan PCR ile en uygun değeri belirleyin.
Öz-tamamlayıcılık uyarısı neden önemlidir?
Kendisiyle veya eş primeriyle eşleşen bir primer, hedefle yarışan dimerler veya saç tokası yapıları oluşturabilir ve ek bantlara neden olabilir.
Ücretsiz araç · tarayıcınızda kez çalıştırma · hesap gerekmez