Biologie / PCR
Calculateur de Tm des amorces (température de fusion)
Calculez la température de fusion d’une amorce de PCR par la méthode des plus proches voisins avec correction de la concentration en sel, la règle de Wallace et la formule du GC, ainsi que son contenu en GC et la présence éventuelle de séquences auto-complémentaires pouvant former des épingles à cheveux ou des dimères.
Calculateur de Tm des amorces (température de fusion): La Tm calculée par la méthode des plus proches voisins additionne l’enthalpie et l’entropie de chaque paire de bases chevauchante à partir de la table unifiée de SantaLucia de 1998, avec des corrections pour les extrémités et la concentration en sel, puis résout Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15. Avec C/4 comme concentration des brins, comme le fait Primer3, elle correspond à la valeur Tm_NN de Biopython à 0.01 °C près : l’amorce inverse M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA à 250 nM et 50 mM Na⁺ donne 56.7 °C. La règle de Wallace, qui compte 2 °C par A ou T et 4 °C par G ou C, donne 68 °C pour cette amorce et ne convient qu’aux oligonucléotides courts. Fonctionne 100 % localement dans votre navigateur, sans aucun téléversement de fichier vers le serveur.
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La méthode des plus proches voisins additionne la stabilité de chaque paire de bases chevauchante, en utilisant les valeurs unifiées de 1998 de SantaLucia avec sa correction liée au sel, et donne la température à laquelle la moitié de l'amorce est liée ; avec C/4 pour la concentration du brin, comme dans Primer3, elle concorde avec le Tm_NN de Biopython à 0.01 °C près. La règle de Wallace et la formule GC sont des approximations plus rapides. Les bonnes amorces de PCR comportent généralement 18–25 bases avec 40–60 % de GC, et l'écart entre les deux amorces d'une paire devrait être d'environ 5 °C au maximum ; une température d'hybridation typique est inférieure de 3–5 °C au Tm le plus bas. Le Mg²⁺ et les dNTP, qui ne sont pas pris en compte ici, augmentent également le Tm.
Recommandations pour la conception des amorces
Visez 18–25 bases, 40–60 % de GC, un G ou un C à l’extrémité 3′, aucune série de quatre bases identiques ou plus, et des valeurs de Tm distantes de 5 °C au maximum pour la paire.
Pour vérifier la séquence du brin matrice et de l’amorce inverse, utilisez les outils de séquence d’ADN.
Concentrations
Augmenter la concentration d’amorces ou la concentration en sel augmente la Tm : pour une même amorce, le passage de 50 à 100 mM de Na⁺ augmente celle-ci d’environ 1–2 °C. Le Mg²⁺, présent à 1,5–2,5 mM dans les tampons de PCR, stabilise davantage les duplex, mais n’est pas modélisé ici.
Pour préparer des solutions mères d’amorces et des dilutions de travail, utilisez la calculatrice de dilution.
Comment l'utiliser
- Collez la séquence de l’amorce, écrite de 5′ à 3′.
- Ajustez les concentrations de l’amorce et du sodium si elles diffèrent de celles de votre tampon.
- Consultez la Tm obtenue avec chaque méthode, le contenu en GC et toute séquence auto-complémentaire.
Confidentialité et limitations
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Outils associés
Questions fréquentes
Quelle Tm dois-je utiliser ?
La valeur obtenue par la méthode des plus proches voisins : elle tient compte de l’ordre des bases et du tampon. Les calculateurs de nombreux fournisseurs de polymérases ajoutent leurs propres corrections liées au tampon ; des écarts de quelques degrés sont donc à prévoir.
Quelle température d’hybridation dois-je régler ?
En général, choisissez une température inférieure de 3–5 °C à la Tm la plus basse de la paire, puis optimisez-la avec une PCR en gradient.
Pourquoi l’avertissement concernant l’auto-complémentarité est-il important ?
Une amorce qui s’apparie avec elle-même ou avec sa partenaire peut former des dimères ou des épingles à cheveux qui entrent en compétition avec la cible et produisent des bandes supplémentaires.
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