生物學 / PCR
引子Tm計算機（熔解溫度）
使用含鹽校正的最近鄰法、Wallace規則和GC公式，計算PCR引子的熔解溫度、GC含量，並警告可能形成髮夾結構或二聚體的自我互補序列。
引子Tm計算機（熔解溫度）: 最近鄰法Tm會根據SantaLucia於1998年建立的統一表格，加入每個重疊鹼基對的焓與熵，以及末端和鹽濃度校正，並解出Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15。以C/4作為鏈濃度，如Primer3所採用的方式，結果與Biopython的Tm_NN相差在0.01 °C以內：M13反向引子AGCGGATAACAATTTCACACAGGA在250 nM和50 mM Na⁺下的結果為56.7 °C。Wallace規則以每個A或T計2 °C、每個G或C計4 °C，該引子的結果為68 °C，僅適合較短的寡核苷酸。 全程在瀏覽器中於本機執行，檔案不會上傳至伺服器。
- 分類
- 學校與讀書工具
- 使用次數
- 在瀏覽器中
- 費用
- 免費・免註冊
- 可用狀態
- 可立即使用
全程在瀏覽器中執行
最近鄰法會使用SantaLucia 1998年的統一數值及其鹽校正，累加每一對重疊鹼基的穩定性，並計算出一半引子與其結合時的溫度；按照Primer3的做法，以C/4作為鏈濃度時，結果與Biopython的Tm_NN相差不超過0.01 °C。Wallace規則和GC公式是較快速的近似方法。良好的PCR引子通常有18–25個鹼基，GC含量為40–60%；一對引子的Tm彼此差距應在約5 °C以內，典型的退火溫度比較低的Tm低3–5 °C。本工具未建模的Mg²⁺和dNTP也會提高Tm。
引子設計指南
建議長度為18–25個鹼基、GC含量為40–60%，3′端有G或C，不要有四個以上相同鹼基連續出現，且一對引子的Tm值彼此相差不超過5 °C。
若要檢查模板與反向引子的序列，請使用DNA序列工具。
濃度
提高引子濃度或鹽濃度會提高Tm：相同的引子從50增加到100 mM Na⁺時，Tm大約會上升1–2 °C。PCR緩衝液含有1.5–2.5 mM的Mg²⁺，能進一步穩定雙股結構，但本工具未將其納入模型。
若要配製引子儲存液與工作稀釋液，請使用稀釋計算機。
使用方式
- 貼上以5′到3′方向書寫的引子。
- 如果緩衝液不同，請調整引子濃度和鈉離子濃度。
- 查看各種方法計算的Tm、GC含量，以及任何自我互補序列。
隱私與限制
所有計算都在您的瀏覽器中執行。
相關工具
常見問題
我應該使用哪個Tm？
請使用最近鄰法的數值：它會考量序列順序和緩衝液。許多聚合酶供應商的計算機會加入自有的緩衝液校正，因此結果可能相差幾度。
退火溫度應該設定為多少？
通常設定為這對引子中較低Tm低3–5 °C的溫度，然後使用梯度PCR進行最佳化。
為什麼自我互補警告很重要？
能與自身或配對引子互補的引子，可能形成二聚體或髮夾結構，與目標序列競爭並產生額外條帶。
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