Biologia / PCR
Calculadora de Tm de primers (Temperatura de fusão)
Calcule a temperatura de fusão de um primer de PCR pelo método do vizinho mais próximo, com correção de sal, pela regra de Wallace e pela fórmula de GC. Veja também o conteúdo de GC e receba um aviso sobre trechos autocomplementares que podem formar grampos ou dímeros.
Calculadora de Tm de primers (Temperatura de fusão): A Tm pelo método do vizinho mais próximo soma a entalpia e a entropia de cada par de bases sobreposto da tabela unificada de SantaLucia de 1998, com correções terminais e de sal, e resolve Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15. Com C/4 como concentração da fita, como o Primer3 usa, o resultado concorda com Tm_NN do Biopython em até 0.01 °C: o primer reverso M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA, a 250 nM e 50 mM Na⁺, resulta em 56.7 °C. A regra de Wallace, com 2 °C por A ou T e 4 °C por G ou C, resulta em 68 °C para esse primer e é adequada apenas para oligos curtos. Roda 100% localmente no seu navegador, sem enviar nenhum arquivo para o servidor.
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O método do vizinho mais próximo soma a estabilidade de cada par de bases sobreposto, usando os valores unificados de 1998 de SantaLucia com sua correção de sal, e fornece a temperatura na qual metade do primer está ligada; com C/4 para a concentração da fita, como o Primer3 usa, ele concorda com o Tm_NN do Biopython em 0.01 °C. A regra de Wallace e a fórmula de GC são aproximações mais rápidas. Bons primers de PCR geralmente têm 18–25 bases e 40–60% de GC, e um par de primers deve estar a aproximadamente 5 °C um do outro; uma temperatura de anelamento típica é 3–5 °C abaixo do Tm mais baixo. Mg²⁺ e dNTPs, que este cálculo não modela, também aumentam o Tm.
Orientações para o design de primers
Busque 18–25 bases, 40–60% de GC, uma base G ou C na extremidade 3′, nenhuma sequência de quatro ou mais bases iguais e valores de Tm com diferença de no máximo 5 °C entre os primers do par.
Para verificar a sequência do molde e do primer reverso, use as ferramentas de sequência de DNA.
Concentrações
Aumentar a concentração do primer ou do sal aumenta a Tm: o mesmo primer ganha aproximadamente 1–2 °C de 50 a 100 mM de Na⁺. O Mg²⁺, presente nos tampões de PCR em 1,5–2,5 mM, estabiliza ainda mais os duplexes, mas não é modelado aqui.
Para preparar estoques de primers e diluições de trabalho, use a calculadora de diluição.
Como usar
- Cole o primer, escrito de 5′ a 3′.
- Ajuste as concentrações do primer e de sódio se o seu tampão for diferente.
- Consulte a Tm de cada método, o conteúdo de GC e qualquer trecho autocomplementar.
Privacidade e limitações
Tudo é calculado no seu navegador.
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Perguntas frequentes
Qual Tm devo usar?
O valor do vizinho mais próximo: ele considera a ordem da sequência e o tampão. As calculadoras de muitos fornecedores de polimerases adicionam suas próprias correções de tampão, portanto espere diferenças de alguns graus.
Qual temperatura de anelamento devo definir?
Geralmente, 3–5 °C abaixo da menor Tm do par; depois, otimize com uma PCR em gradiente.
Por que o aviso de autocomplementaridade é importante?
Um primer que se pareia consigo mesmo ou com seu par pode formar dímeros ou grampos que competem com o alvo e produzem bandas extras.
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