जीव विज्ञान / PCR
Primer Tm कैलकुलेटर (गलन तापमान)
सॉल्ट सुधार के साथ निकटतम-पड़ोसी विधि, Wallace नियम और GC फ़ॉर्मूला इस्तेमाल करके PCR प्राइमर का गलन तापमान निकालें। साथ ही GC मात्रा और हेयरपिन या डाइमर बना सकने वाले स्व-समपूरक अनुक्रमों की चेतावनी देखें।
Primer Tm कैलकुलेटर (गलन तापमान): निकटतम-पड़ोसी Tm, SantaLucia की 1998 की unified table से हर overlapping base pair की एन्थैल्पी और एंट्रॉपी को terminal और salt corrections के साथ जोड़ता है, फिर Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15 से गणना करता है। Primer3 की तरह strand concentration के रूप में C/4 इस्तेमाल करने पर, यह Biopython के Tm_NN से 0.01 °C के भीतर मिलता है: 250 nM और 50 mM Na⁺ पर M13 reverse primer AGCGGATAACAATTTCACACAGGA का मान 56.7 °C है। Wallace नियम, जिसमें हर A या T के लिए 2 °C और हर G या C के लिए 4 °C जोड़े जाते हैं, इसके लिए 68 °C देता है और केवल छोटे oligos के लिए उपयुक्त है। यह आपके ब्राउज़र में 100% स्थानीय रूप से चलता है और सर्वर पर कोई फ़ाइल अपलोड नहीं होती।
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- मुफ़्त · साइन अप की ज़रूरत नहीं
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- इस्तेमाल के लिए तैयार
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निकटतम-पड़ोसी विधि, SantaLucia के 1998 के salt correction सहित unified values का उपयोग करके, ओवरलैप करने वाले बेस के हर जोड़े की स्थिरता को जोड़ती है और वह तापमान देती है जिस पर आधा प्राइमर बंधा होता है; Primer3 के अनुसार strand concentration के लिए C/4 उपयोग करने पर यह Biopython के Tm_NN से 0.01 °C तक मेल खाती है। Wallace rule और GC formula तेज़ अनुमान देते हैं। अच्छे PCR प्राइमर आमतौर पर 18–25 बेस के होते हैं और उनमें 40–60% GC होता है। प्राइमर की एक जोड़ी के Tm में लगभग 5 °C से अधिक का अंतर नहीं होना चाहिए; सामान्य annealing temperature कम Tm से 3–5 °C नीचे होता है। Mg²⁺ और dNTPs, जिन्हें यह विधि मॉडल नहीं करती, Tm को और बढ़ाते हैं।
Primer design के दिशानिर्देश
18–25 bases, 40–60% GC, 3′ end पर G या C, किसी एक base के चार या उससे अधिक लगातार दोहराव से बचने और pair के Tm values में 5 °C से अधिक अंतर न रखने का लक्ष्य रखें।
Template और reverse primer के sequence की जाँच करने के लिए DNA टूल्स इस्तेमाल करें।
Concentrations
Primer concentration या salt बढ़ाने से Tm बढ़ता है: 50 से 100 mM Na⁺ तक जाने पर वही primer लगभग 1–2 °C बढ़ जाता है। Mg²⁺, जिसे PCR buffers में 1.5–2.5 mM पर रखा जाता है, duplexes को और स्थिर करता है, लेकिन यहाँ इसका model नहीं बनाया गया है।
Primer stocks और working dilutions तैयार करने के लिए तनुकरण इस्तेमाल करें।
इस्तेमाल करने का तरीका
- प्राइमर को 5′ से 3′ दिशा में लिखकर पेस्ट करें।
- अगर आपका बफ़र अलग है, तो प्राइमर और सोडियम की सांद्रता समायोजित करें।
- हर विधि से Tm, GC मात्रा और कोई भी स्व-समपूरक अनुक्रम देखें।
गोपनीयता और सीमाएँ
सारी गणना आपके ब्राउज़र में होती है।
संबंधित टूल्स
अक्सर पूछे जाने वाले सवाल
मुझे कौन-सा Tm इस्तेमाल करना चाहिए?
निकटतम-पड़ोसी मान: इसमें अनुक्रम का क्रम और बफ़र, दोनों शामिल होते हैं। कई polymerase suppliers के कैलकुलेटर अपने बफ़र सुधार जोड़ते हैं, इसलिए कुछ डिग्री का अंतर अपेक्षित है।
मुझे annealing temperature कितना सेट करना चाहिए?
आमतौर पर जोड़ी के कम Tm से 3–5 °C कम रखें, फिर gradient PCR से अनुकूलित करें।
स्व-समपूरकता की चेतावनी क्यों महत्वपूर्ण है?
जो प्राइमर अपने साथ या अपने partner के साथ pairing कर सकता है, वह dimer या hairpin बना सकता है। ये target के साथ प्रतिस्पर्धा करके अतिरिक्त bands दे सकते हैं।
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