生物学 / PCR
プライマーTm計算ツール（融解温度）
塩補正付きの最近傍法、Wallace則、GC式でPCRプライマーの融解温度を計算します。GC含量に加え、ヘアピンやダイマーを形成する可能性がある自己相補的な配列領域も警告します。
プライマーTm計算ツール（融解温度）: 最近傍法によるTmは、SantaLuciaの1998年統一表に基づき、重なり合う各塩基対のエンタルピーとエントロピーを加算し、末端補正と塩補正を適用したうえで、Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15を解いて求めます。Primer3で使われる鎖濃度C/4を用いると、BiopythonのTm_NNと0.01 °C以内で一致します。250 nM、50 mM Na⁺の条件におけるM13 reverse primer AGCGGATAACAATTTCACACAGGAは56.7 °Cです。AまたはT 1個につき2 °C、GまたはC 1個につき4 °CとするWallace則では68 °Cとなりますが、短いオリゴにのみ適しています。 サーバーへのファイルアップロードは一切なく、100%ブラウザ内でローカル実行します。
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最近接塩基対法では、重なり合う各塩基対の安定性を合計します。SantaLucia 1998の統一値と塩補正を使用し、プライマーの半分が結合する温度を算出します。Primer3と同様に鎖濃度へC/4を用いると、BiopythonのTm_NNと0.01 °Cまで一致します。Wallace則とGC式は、より速く計算できる近似値です。適切なPCRプライマーは通常18–25塩基でGC含量が40–60%であり、プライマー対のTmは互いに約5 °C以内に収める必要があります。一般的なアニーリング温度は、低い方のTmより3–5 °C低い温度です。この計算ではモデル化していないMg²⁺とdNTPもTmを上昇させます。
プライマー設計の指針
長さは18–25塩基、GC含量は40–60%、3′末端はGまたはCを目安にしてください。同じ塩基が4個以上連続する配列は避け、ペアのTm値は互いに5 °C以内に収めます。
テンプレートと逆向きプライマーの配列を確認するには、DNA配列ツールを使用してください。
濃度
プライマー濃度または塩濃度を上げるとTmが上昇します。同じプライマーでも、Na⁺を50から100 mMにすると、およそ1–2 °C上昇します。PCRバッファーに1.5–2.5 mM含まれるMg²⁺は、二本鎖をさらに安定化しますが、ここではモデル化していません。
プライマーのストック溶液と作業用希釈液を調製するには、希釈計算機を使用してください。
使い方
- 5′から3′の向きで記述したプライマーを貼り付けます。
- バッファーの条件が異なる場合は、プライマー濃度とナトリウム濃度を調整します。
- 各手法によるTm、GC含量、自己相補的な配列領域を確認します。
プライバシーと制限事項
すべての計算はブラウザ内で行われます。
関連ツール
よくある質問
どのTmを使えばよいですか？
最近傍法の値を使ってください。配列の順序とバッファーを考慮できるためです。多くのポリメラーゼメーカーの計算ツールでは独自のバッファー補正が加えられるため、数度の差が出ることがあります。
アニーリング温度は何度に設定すればよいですか？
通常は、プライマーペアの低い方のTmより3–5 °C低く設定し、その後グラジエントPCRで最適化します。
自己相補性の警告が重要なのはなぜですか？
プライマーが自分自身または相手のプライマーと結合すると、ダイマーやヘアピンを形成して標的との反応を競合し、余分なバンドが生じることがあります。
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