Biologia / PCR
Calcolatore Tm dei primer (temperatura di fusione)
Calcola la temperatura di fusione di un primer PCR con il metodo nearest-neighbour e la correzione per i sali, la regola di Wallace e la formula GC, insieme al contenuto GC e a un avviso sui tratti auto-complementari che possono formare forcine o dimeri.
Calcolatore Tm dei primer (temperatura di fusione): La Tm nearest-neighbour somma l’entalpia e l’entropia di ogni coppia di basi sovrapposta dalla tabella unificata di SantaLucia del 1998, applica le correzioni terminali e per i sali e risolve Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273,15. Con C/4 come concentrazione dei filamenti, come in Primer3, il risultato concorda con Tm_NN di Biopython entro 0,01 °C: il primer reverse M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA a 250 nM e 50 mM Na⁺ è 56,7 °C. La regola di Wallace, 2 °C per ogni A o T e 4 °C per ogni G o C, restituisce 68 °C per questo primer ed è adatta solo a oligo corti. Funziona al 100% localmente nel browser, senza caricare file sul server.
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Il metodo dei vicini più prossimi somma la stabilità di ogni coppia sovrapposta di basi, usando i valori unificati del 1998 di SantaLucia con la sua correzione per il sale, e restituisce la temperatura alla quale metà del primer è legata; usando C/4 per la concentrazione del filamento, come fa Primer3, coincide con Tm_NN di Biopython entro 0,01 °C. La regola di Wallace e la formula GC sono approssimazioni più rapide. I buoni primer per PCR hanno solitamente 18–25 basi con il 40–60% di GC e una coppia di primer dovrebbe differire di circa 5 °C o meno; una temperatura di annealing tipica è 3–5 °C inferiore alla Tm più bassa. Anche Mg²⁺ e dNTP, che questo calcolo non considera, aumentano la Tm.
Linee guida per la progettazione dei primer
Punta a 18–25 basi, 40–60% di GC, una G o una C all'estremità 3′, nessuna sequenza consecutiva di quattro o più basi uguali e valori di Tm entro 5 °C l'uno dall'altro per la coppia.
Per controllare la sequenza del template e del primer inverso, usa gli strumenti per sequenze di DNA.
Concentrazioni
Aumentare la concentrazione del primer o del sale aumenta la Tm: lo stesso primer guadagna circa 1–2 °C passando da 50 a 100 mM di Na⁺. Mg²⁺, contenuto nei buffer per PCR a 1,5–2,5 mM, stabilizza ulteriormente i duplex, ma qui non viene modellato.
Per preparare soluzioni stock e diluizioni di lavoro dei primer, usa il calcolatore di diluizione.
Come usarlo
- Incolla il primer, scritto da 5′ a 3′.
- Regola le concentrazioni del primer e del sodio se il tuo buffer è diverso.
- Leggi la Tm calcolata con ciascun metodo, il contenuto GC ed eventuali tratti auto-complementari.
Privacy e limitazioni
Tutto viene calcolato nel browser.
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Domande frequenti
Quale Tm devo usare?
Il valore nearest-neighbour: tiene conto dell’ordine della sequenza e del buffer. I calcolatori di molti fornitori di polimerasi applicano correzioni proprie per il buffer, quindi sono possibili differenze di alcuni gradi.
Quale temperatura di annealing devo impostare?
Di solito 3–5 °C al di sotto della Tm più bassa della coppia, quindi ottimizzala con una PCR a gradiente.
Perché è importante l’avviso sull’auto-complementarità?
Un primer che si appaia con se stesso o con il suo partner può formare dimeri o forcine, che competono con il target e producono bande aggiuntive.
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