Биология / PCR
Калькулятор Tm праймера (температура плавления)
Рассчитайте температуру плавления праймера для ПЦР методом ближайших соседей с поправкой на соль, по правилу Уоллеса и формуле GC. Также определите содержание GC и получите предупреждение о самокомплементарных участках, способных образовывать шпильки или димеры.
Калькулятор Tm праймера (температура плавления): При расчёте Tm методом ближайших соседей учитываются энтальпия и энтропия каждой перекрывающейся пары оснований по унифицированной таблице SantaLucia 1998 года, а также поправки на концевые участки и соль. Затем решается уравнение Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15. При C/4 в качестве концентрации цепи, как в Primer3, результат отличается от Tm_NN в Biopython не более чем на 0.01 °C: для обратного праймера M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA при 250 nM и 50 mM Na⁺ он составляет 56.7 °C. Правило Уоллеса — 2 °C для каждого A или T и 4 °C для каждого G или C — даёт для этой последовательности 68 °C и подходит только для коротких олигонуклеотидов. Работает на 100% локально в вашем браузере, файлы на сервер не загружаются.
- Категория
- Инструменты для учёбы и школы
- Запуски
- В вашем браузере
- Стоимость
- Бесплатно · без регистрации
- Доступность
- Готово к использованию
Полностью работает в браузере
Метод ближайших соседей суммирует стабильность каждой перекрывающейся пары оснований, используя унифицированные значения SantaLucia 1998 с поправкой на концентрацию соли, и определяет температуру, при которой связана половина праймера; при концентрации цепи C/4, как в Primer3, результат совпадает с Tm_NN из Biopython с точностью до 0.01 °C. Правило Уоллеса и формула GC дают более быстрые приближённые оценки. Хорошие праймеры для PCR обычно содержат 18–25 оснований и имеют 40–60% GC, а разница между праймерами одной пары должна составлять примерно не более 5 °C; типичная температура отжига на 3–5 °C ниже меньшего значения Tm. Mg²⁺ и dNTPs, которые не учитываются в этом расчёте, также повышают Tm.
Рекомендации по разработке праймеров
Стремитесь к длине 18–25 оснований, содержанию GC 40–60%, наличию G или C на конце 3′, отсутствию последовательностей из четырёх и более одинаковых оснований и разнице значений Tm не более 5 °C для пары.
Чтобы проверить матрицу и последовательность обратного праймера, воспользуйтесь инструментами для работы с DNA-последовательностями.
Концентрации
Повышение концентрации праймера или соли повышает Tm: у одного и того же праймера прирост составляет примерно 1–2 °C при изменении концентрации Na⁺ с 50 до 100 mM. Mg²⁺, который содержится в PCR-буферах в концентрации 1.5–2.5 mM, дополнительно стабилизирует дуплексы, но здесь не учитывается.
Чтобы приготовить исходные растворы праймеров и рабочие разведения, воспользуйтесь калькулятором разведения.
Как пользоваться
- Вставьте последовательность праймера, записанную в направлении 5′ → 3′.
- При необходимости измените концентрации праймера и натрия в соответствии с вашим буфером.
- Сравните Tm по каждому методу, содержание GC и найденные самокомплементарные участки.
Конфиденциальность и ограничения
Все расчёты выполняются в вашем браузере.
Похожие инструменты
Часто задаваемые вопросы
Какое значение Tm использовать?
Значение, рассчитанное методом ближайших соседей: оно учитывает порядок последовательности и состав буфера. В калькуляторах многих производителей полимераз используются собственные поправки на буфер, поэтому результаты могут отличаться на несколько градусов.
Какую температуру отжига установить?
Обычно на 3–5 °C ниже меньшего значения Tm в паре праймеров; затем оптимизируйте её с помощью градиентной ПЦР.
Почему важно предупреждение о самокомплементарности?
Праймер, способный образовывать пары сам с собой или с партнёром, может формировать димеры или шпильки. Они конкурируют с мишенью и могут приводить к появлению дополнительных полос.
Бесплатный инструмент · запусков: в вашем браузере · аккаунт не нужен