Sinh học / PCR
Máy tính Tm mồi (Nhiệt độ nóng chảy)
Tính nhiệt độ nóng chảy của mồi PCR bằng phương pháp lân cận gần nhất có hiệu chỉnh muối, quy tắc Wallace và công thức GC; đồng thời xem hàm lượng GC và cảnh báo về các đoạn tự bổ sung có thể tạo cấu trúc kẹp tóc hoặc dimer.
Máy tính Tm mồi (Nhiệt độ nóng chảy): Tm theo phương pháp lân cận gần nhất cộng enthalpy và entropy của từng cặp bazơ chồng lấn từ bảng thống nhất năm 1998 của SantaLucia, kèm hiệu chỉnh đầu mút và muối, rồi giải công thức Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273,15. Với C/4 là nồng độ sợi, như Primer3 sử dụng, kết quả khớp với Tm_NN của Biopython trong phạm vi 0,01 °C: mồi ngược M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ở 250 nM và 50 mM Na⁺ có Tm là 56,7 °C. Quy tắc Wallace, tính 2 °C cho mỗi A hoặc T và 4 °C cho mỗi G hoặc C, cho kết quả 68 °C với mồi này và chỉ phù hợp với các oligo ngắn. Chạy 100% cục bộ trong trình duyệt của bạn, không có tệp nào được tải lên máy chủ.
- Danh mục
- Công cụ học tập và trường học
- Lượt chạy
- Trong trình duyệt của bạn
- Chi phí
- Miễn phí · không cần đăng ký
- Trạng thái khả dụng
- Sẵn sàng sử dụng
Chạy hoàn toàn trong trình duyệt của bạn
Phương pháp lân cận gần nhất cộng độ ổn định của từng cặp base chồng lấn, sử dụng các giá trị thống nhất năm 1998 của SantaLucia cùng với hiệu chỉnh muối của ông, rồi cho biết nhiệt độ tại đó một nửa lượng mồi được gắn; với nồng độ mạch là C/4 như Primer3 sử dụng, kết quả khớp với Tm_NN của Biopython đến 0,01 °C. Quy tắc Wallace và công thức GC là các phép xấp xỉ nhanh hơn. Mồi PCR tốt thường dài 18–25 base với 40–60% GC, và một cặp mồi nên có Tm chênh nhau khoảng 5 °C trở xuống; nhiệt độ gắn mồi điển hình thấp hơn Tm thấp hơn 3–5 °C. Mg²⁺ và dNTP, vốn không được mô hình hóa ở đây, cũng làm tăng Tm.
Hướng dẫn thiết kế mồi
Nên chọn độ dài 18–25 base, 40–60% GC, có G hoặc C ở đầu 3′, không có chuỗi gồm bốn base trở lên giống nhau, và các giá trị Tm của một cặp chênh nhau không quá 5 °C.
Để kiểm tra trình tự của khuôn và mồi ngược, hãy sử dụng các công cụ trình tự DNA.
Nồng độ
Tăng nồng độ mồi hoặc muối sẽ làm tăng Tm: cùng một mồi tăng khoảng 1–2 °C khi nồng độ Na⁺ tăng từ 50 lên 100 mM. Mg²⁺, có trong các dung dịch đệm PCR ở nồng độ 1,5–2,5 mM, giúp ổn định các chuỗi kép hơn nữa nhưng không được mô hình hóa ở đây.
Để pha dung dịch gốc và các dung dịch mồi làm việc, hãy sử dụng máy tính pha loãng.
Cách sử dụng
- Dán trình tự mồi theo chiều 5′ đến 3′.
- Điều chỉnh nồng độ mồi và natri nếu dung dịch đệm của bạn khác với mặc định.
- Xem Tm theo từng phương pháp, hàm lượng GC và mọi đoạn tự bổ sung nếu có.
Quyền riêng tư và giới hạn
Mọi phép tính đều được thực hiện trong trình duyệt của bạn.
Công cụ liên quan
Câu hỏi thường gặp
Tôi nên sử dụng Tm nào?
Giá trị theo phương pháp lân cận gần nhất: phương pháp này tính đến thứ tự trình tự và dung dịch đệm. Máy tính của nhiều nhà cung cấp polymerase có thêm hiệu chỉnh riêng cho dung dịch đệm, vì vậy kết quả có thể chênh lệch vài độ.
Tôi nên đặt nhiệt độ bắt cặp là bao nhiêu?
Thông thường, đặt thấp hơn 3–5 °C so với Tm thấp hơn trong cặp, sau đó tối ưu bằng PCR gradient.
Tại sao cảnh báo tự bổ sung lại quan trọng?
Mồi có thể bắt cặp với chính nó hoặc với mồi còn lại, tạo thành dimer hoặc cấu trúc kẹp tóc cạnh tranh với trình tự đích và tạo thêm băng.
Công cụ miễn phí · trong trình duyệt của bạn lượt chạy · không cần tài khoản