Biología / PCR
Calculadora de Tm de primers (temperatura de fusión)
Calcula la temperatura de fusión de un primer de PCR mediante el método del vecino más cercano con corrección por sales, la regla de Wallace y la fórmula de GC, junto con su contenido de GC y una advertencia sobre tramos autocomplementarios que pueden formar8?
Calculadora de Tm de primers (temperatura de fusión): La Tm del vecino más cercano suma la entalpía y la entropía de cada par de bases superpuesto de la tabla unificada de SantaLucia de 1998, con correcciones terminales y por sales, y resuelve Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273,15. Con C/4 como concentración de la hebra, tal como usa Primer3, coincide con Tm_NN de Biopython con una diferencia de hasta 0,01 °C: el primer inverso M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA a 250 nM y 50 mM Na⁺ es 56,7 °C. La regla de Wallace, 2 °C por cada A o T y 4 °C por cada G o C, da 68 °C para este primer y solo es adecuada para oligonucleótidos cortos. Funciona al 100 % en tu navegador, sin subir archivos a ningún servidor.
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El método del vecino más cercano suma la estabilidad de cada par de bases superpuesto, usando los valores unificados de SantaLucia de 1998 con su corrección de sal, y proporciona la temperatura a la que la mitad del cebador está unido; con C/4 para la concentración de la cadena, como usa Primer3, coincide con Tm_NN de Biopython con una diferencia de 0.01 °C. La regla de Wallace y la fórmula de GC son aproximaciones más rápidas. Los buenos cebadores de PCR suelen tener 18–25 bases y 40–60% de GC, y la diferencia entre los miembros de un par de cebadores debería ser de aproximadamente 5 °C como máximo; una temperatura de alineamiento habitual es 3–5 °C inferior al Tm más bajo. El Mg²⁺ y los dNTP, que este cálculo no modela, también elevan el Tm.
Pautas para diseñar cebadores
Procura que tengan 18–25 bases, entre 40–60% de GC, una G o C en el extremo 3′, ninguna repetición de cuatro o más bases iguales y valores de Tm con una diferencia máxima de 5 °C entre ambos cebadores.
Para comprobar la secuencia del molde y del cebador inverso, usa las herramientas de secuencias de ADN.
Concentraciones
Aumentar la concentración de cebadores o de sal eleva la Tm: el mismo cebador aumenta aproximadamente 1–2 °C entre 50 y 100 mM de Na⁺. El Mg²⁺, que los tampones de PCR contienen en concentraciones de 1,5–2,5 mM, estabiliza aún más los dúplexes, pero no se modela aquí.
Para preparar soluciones madre de cebadores y diluciones de trabajo, usa la calculadora de diluciones.
Cómo se usa
- Pega el primer, escrito de 5′ a 3′.
- Ajusta las concentraciones del primer y del sodio si tu tampón es diferente.
- Consulta la Tm de cada método, el contenido de GC y cualquier tramo autocomplementario.
Privacidad y límites
Todo se calcula en tu navegador.
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Preguntas frecuentes
¿Qué Tm debería usar?
La del vecino más cercano: tiene en cuenta el orden de la secuencia y el tampón. Las calculadoras de muchos proveedores de polimerasas aplican sus propias correcciones del tampón, así que es normal que haya diferencias de varios grados.
¿Qué temperatura de alineamiento debería establecer?
Normalmente, 3–5 °C por debajo de la Tm más baja del par; después, optimízala con una PCR en gradiente.
¿Por qué es importante la advertencia de autocomplementariedad?
Un primer que se aparea consigo mismo o con su pareja puede formar dímeros u horquillas que compiten con la diana y producen bandas adicionales.
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