Biologija / PCR
Kalkulator Tm prajmera (temperatura topljenja)
Izračunajte temperaturu topljenja PCR prajmera metodom najbližih suseda uz korekciju za so, Wallaceovim pravilom i GC formulom, kao i njegov GC sadržaj i upozorenje na samokomplementarne nizove koji mogu formirati ukosnice ili dimere.
Kalkulator Tm prajmera (temperatura topljenja): Tm po metodi najbližih suseda sabira entalpiju i entropiju svakog preklapajućeg para baza iz objedinjene tabele SantaLucia iz 1998. godine, uz terminalne i korekcije za so, a zatim rešava jednačinu Tm = ΔH ÷ (ΔS + R ln(C/4)) − 273.15. Kada se koristi C/4 kao koncentracija lanca, kao u Primer3, rezultat se slaže sa Tm_NN iz Biopython-a u okviru 0.01 °C: reverzni prajmer M13 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA pri 250 nM i 50 mM Na⁺ ima vrednost 56.7 °C. Wallaceovo pravilo, 2 °C po A ili T i 4 °C po G ili C, za njega daje 68 °C i odgovara samo kratkim oligonukleotidima. Radi 100% lokalno u vašem pregledaču, bez otpremanja datoteka na server.
- Kategorija
- Alatke za školu i učenje
- Pokretanja
- U vašem pregledaču
- Trošak
- Besplatno · bez registracije
- Dostupnost
- Spremno za upotrebu
U potpunosti radi u vašem pregledaču
Metod najbližih suseda sabira stabilnost svakog preklapajućeg para baza, koristeći objedinjene vrednosti SantaLucia iz 1998. sa njegovom korekcijom za so, i daje temperaturu pri kojoj je polovina prajmera vezana; sa C/4 za koncentraciju niti, kao što koristi Primer3, slaže se sa Biopython vrednošću Tm_NN do 0.01 °C. Wallaceovo pravilo i GC formula predstavljaju brže aproksimacije. Dobri PCR prajmeri obično imaju 18–25 baza i 40–60% GC, a razlika između para prajmera trebalo bi da bude oko 5 °C ili manja; tipična temperatura sparivanja je 3–5 °C ispod niže vrednosti Tm. Mg²⁺ i dNTP-ovi, koje ovaj proračun ne modeluje, takođe povećavaju Tm.
Smernice za dizajniranje prajmera
Ciljajte na 18–25 baza, 40–60% GC, G ili C na 3′ kraju, bez nizova od četiri ili više istih baza i sa vrednostima Tm koje se za dati par razlikuju najviše 5 °C.
Da biste proverili matricu i sekvencu reverznog prajmera, koristite alate za DNK sekvence.
Koncentracije
Povećanje koncentracije prajmera ili soli povećava Tm: isti prajmer dobija približno 1–2 °C pri povećanju koncentracije Na⁺ sa 50 na 100 mM. Mg²⁺, koji se u PCR puferima nalazi u koncentraciji od 1.5–2.5 mM, dodatno stabilizuje dvolančane strukture, ali ovde nije uključen u model.
Za pripremu matičnih rastvora prajmera i radnih razblaženja koristite kalkulator razblaživanja.
Kako se koristi
- Nalepite prajmer, zapisan od 5′ do 3′.
- Prilagodite koncentracije prajmera i natrijuma ako se vaš pufer razlikuje.
- Pogledajte Tm po svakoj metodi, GC sadržaj i eventualni samokomplementarni niz.
Privatnost i ograničenja
Sve se izračunava u vašem pregledaču.
Srodne alatke
Često postavljana pitanja
Koju Tm vrednost treba da koristim?
Vrednost dobijenu metodom najbližih suseda: ona uzima u obzir redosled sekvence i pufer. Kalkulatori mnogih proizvođača polimeraza dodaju sopstvene korekcije za pufer, pa očekujte razlike od nekoliko stepeni.
Koju temperaturu vezivanja treba da podesim?
Obično 3–5 °C ispod niže Tm vrednosti para, a zatim je optimizujte gradijentnim PCR-om.
Zašto je važno upozorenje o samokomplementarnosti?
Prajmer koji se uparuje sam sa sobom ili sa svojim parom može formirati dimere ili ukosnice koje se takmiče sa ciljnom sekvencom i stvaraju dodatne trake.
Besplatan alat · pokretanja: u vašem pregledaču · nalog nije potreban